近日，西南大学生命科学学院张勇教授课题组及其合作团队于Plant Communications在线发表了题为：“IsDge10 is a hypercompact TnpB nuclease that confers efficient genome editing in rice”的研究论文。该研究工作在水稻中比较了多个被认为是Cas9、Cas12a核酸酶祖先的IscB家族、TnpB家族和Fanzor家族的核酸酶在植物中的基因组编辑活性，开发了基于TnpB家族成员IsDge10的单基因与多基因编辑工具，深入探讨了IsDge10系统在水稻中的编辑模式及编辑特异性，提供了紧凑型IsDge10定向敲除植物基因组的编辑方案，丰富了植物基因组编辑工具箱。
近年来，CRISPR-Cas9、Cas12a核酸酶被广泛应用于动、植物及微生物基因功能解析、新种质创制工作中。然而，现有的Cas9、Cas12a核酸酶尺寸较大 （>1200 aa），影响了基因组编辑系统的递送效率。因此，进一步挖掘小型化的核酸酶新成员，构建紧凑、高效、精准、应用范围广的基因组编辑新系统一直是研究者努力的重要方向。2023年，来源于IscB家族、TnpB家族和Fanzor家族的核酸酶陆续被报道，这些核酸酶具有空间结构紧凑、尺寸小的优势 （约400AA），显示了作为基因组编辑工具的潜在应用价值。然而，现有研究报道仅给出了IscB、TnpB和Fanzor在哺乳动物细胞中的明确编辑活性实验数据，而这些编辑工具能否在植物中进行基因组编辑仍有待研究 (Han et al., 2023; Saito et al., 2023; Xiang et al., 2023)。
作者从来源于IscB、TnpB和Fanzor的6种不同的核酸酶中筛选得到了在水稻中编辑活性最好的IsDge10系统，通过水稻原生质体转化与扩增子通量测序对其编辑效率、编辑模式、编辑特异性等进行了分析。并基于此前开发的高效RZ核酸酶及双Pol II驱动CRISPR-Cas系统 (Tang et al., 2017; Tang et al., 2016; Zhang et al., 2021)，成功开发了IsDge10多基因编辑系统，实现了基于IsDge10系统的水稻单基因编辑、多基因编辑。全文主要研究结果如下：
1、 为了探究TnpB、IscB和Fanzor能否在水稻中进行基因组编辑，作者选择了源于TnpB的IsDge10、IsDra2、IsYmu1、IsAam1，源于IscB的enIscB以及来源于Fanzor的SpuFz1（图1A），首先构建了通过II型启动子驱动核酸酶+III型启动子驱动相应guide RNA的表达（图1B）。基于水稻原生质体双荧光报告系统初筛，发现IsDge10、IsAam1、enIscB和SpuFz1在水稻细胞中显示了RNA引导的DNA特异编辑活性。进一步，作者基于水稻原生质体瞬时转化与扩增子通量测序策略，对IsDge10、IsAam1、enIscB和SpuFz1对水稻內源基因组DNA位点的编辑效率、编辑模式和编辑特异性进行了分析。结果表明：1）IsDge10编辑系统，在7个水稻原生质体测试的位点中均能够进行编辑，其中活性最高达到15%，编辑能力显著优于其他三种编辑系统（图1C）；2）针对IsDge10系统的编辑模式进行分析发现，IsDge10在水稻中主要产生TAM远端13-23bp区间6-10bp的多碱基删除（图1D， 图1E）；3）针对IsDge10系统的脱靶分析中，发现较on-target编辑活性相比，临近TAM 1-14bp处2bp的错配即可使IsDge10丧失编辑活性，15-20bp处2bp的错配降低IsDge10编辑活性（图1F），说明IsDge10核酸酶系统是一个高保真的、精准的基因组编辑工具。同时，基于IsDge10编辑系统，在7个水稻稳定转化的测试的位点中均能够进行编辑，编辑效率最高达到25%（图1G），说明IsDge10能够在水稻中介导可遗传的编辑。
图1. 基于IsDge10的植物单基因编辑系统构建、活性评价、编辑模式分析及特异性分析
2、 为了探究IsDge10在水稻基因组中的多基因编辑能力，作者开发了基于高效RZ核酸酶及双Pol II驱动的IsDge10系统（图2A），并通过水稻原生质体转化，与扩增子通量测序策略对IsDge10多基因编辑系统的编辑能力与编辑模式进行了分析。结果表明：1）IsDge10多基因编辑系统，在7个水稻原生质体测试位点均能够进行编辑（图2B）；2）针对IsDge10多基因编辑系统的编辑模式分析发现，主要产生TAM远端13-23bp区间6-10bp的多碱基删除（图2C， 图2D），这与单基因编辑系统的编辑模式一致。这些结果说明基于高效RZ核酸酶及双Pol II驱动的IsDge10多基因编辑系统能够在水稻中同时对多个位点进行编辑。
图2. 基于IsDge10的植物多基因编辑系统构建、活性评价及编辑模式分析
值得说明的是，本文开发的TnpB家族成员IsDge10核酸酶植物编辑系统源于2023年中国科学院动物研究所王皓毅研究员团队从头挖掘的TnpB家族成员(Xiang et al., 2023)，具备明显的知识产权原创属性，为我国开发独立自主的植物（动物）基因组编辑新系统提供了借鉴。
电子科技大学博士生张瑞为论文第一作者，西南大学生命科学学院张勇教授、马里兰大学Yiping Qi教授为论文共同通讯作者，研究工作得到了国家科技重大专项、国家自然科学基金等项目的资助。
论文链接：
https://www.cell.com/plant-communications/fulltext/S2590-3462(24)00422-X
References:
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Saito, M., Xu, P., Faure, G., Maguire, S., Kannan, S., Altae-Tran, H., Vo, S., Desimone, A., Macrae, R.K., and Zhang, F. (2023). Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease. Nature 10.1038/s41586-023-06356-2.
Tang, X., Zheng, X., Qi, Y., Zhang, D., Cheng, Y., Tang, A., Voytas, D.F., and Zhang, Y. (2016). A Single Transcript CRISPR-Cas9 System for Efficient Genome Editing in Plants. Mol Plant 9:1088-1091. 10.1016/j.molp.2016.05.001.
Tang, X., Lowder, L.G., Zhang, T., Malzahn, A.A., Zheng, X., Voytas, D.F., Zhong, Z., Chen, Y., Ren, Q., Li, Q., et al. (2017). A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants. Nat Plants 3:17018. 10.1038/nplants.2017.18.
Xiang, G., Li, Y., Sun, J., Huo, Y., Cao, S., Cao, Y., Guo, Y., Yang, L., Cai, Y., Zhang, Y.E., et al. (2023). Evolutionary mining and functional characterization of TnpB nucleases identify efficient miniature genome editors. Nat Biotechnol 10.1038/s41587-023-01857-x.
Zhang, Y., Ren, Q., Tang, X., Liu, S., Malzahn, A.A., Zhou, J., Wang, J., Yin, D., Pan, C., Yuan, M., et al. (2021). Expanding the scope of plant genome engineering with Cas12a orthologs and highly multiplexable editing systems. Nat Commun 12:1944. 10.1038/s41467-021-22330-w.
