近日，我院含弘研究员张宏晨与重庆医科大学基础医学院邵世鹏教授团队合作在RNA单分子成像领域取得重要进展，成功开发出一种紧凑型高保真RNA成像平台—CDegSR（CRISPR-mediated Degron-based Signal Restoration）（图1），研究成果发表在 Advanced Science 上。技术通过融合蛋白质工程改造与条件性蛋白稳定性调控策略，首次在活细胞中实现了对内源性RNA的高信噪比单分子实时追踪，为解析基因表达的时空动态规律提供了有力的工具支撑。

图1：高保真RNA成像平台—CDegSR（CRISPR-mediated Degron-based Signal Restoration

活细胞中RNA的动态变化是基因表达调控的关键环节，然而，传统成像策略长期受制于技术瓶颈，荧光蛋白类探针因背景干扰强、信噪比低，难以实现对单个RNA分子的清晰识别；而以CRISPR-Cas13为代表的可编程工具虽具优势，但其效应蛋白分子量过大（约130–150 kDa），不仅对靶标RNA产生显著的空间阻碍，也因载体容量限制而难以经由腺相关病毒等小型递送系统高效转入细胞。因此，在不显著扰动靶分子前提下实现内源RNA的高灵敏度、单分子级可视化，始终是该领域悬而未决的核心科学挑战。

针对上述难题，研究团队从蛋白质结构工程入手，基于冷冻电镜解析的PspCas13b-crRNA-tgRNA三元复合物结构，有选择性地去除HEPN1与HEPN2两个核酸酶结构域，将效应蛋白压缩至仅含核心识别区（REC lobe）的约70 kDa微型版本，命名为miniCas13。该设计不仅使蛋白尺寸缩减至原有的一半，也有效削弱了其对RNA靶点的位阻效应，并提升了成像的持续稳定性。

然而，精简后的miniCas13仍为“常亮型”荧光蛋白，溶液中游离的未结合效应器会持续产生非特异性背景。为此，研究团队引入环状排列（Circular Permutation）策略，将蛋白的天然末端通过柔性连接子融合，并在靠近RNA结合界面的第423位氨基酸处开辟新的末端。在此基础上，在新末端融合了富含精氨酸的降解信号（RRRG degron），使得未结合靶标的miniCas13被蛋白酶体快速清除，而一旦结合RNA，该降解信号因空间位阻被遮挡，蛋白随之稳定存留。这种“结合即稳定”的智能调控机制，最终赋予CDegSR近二十倍的荧光诱导倍数，其信噪比远优于传统dCas13系统。

在单分子成像应用层面，团队靶向POLR2A（RNA聚合酶II最大亚基）mRNA，设计了24条crRNA组合，并通过慢病毒文库高效共递送，实现单个mRNA分子上多价CDegSR效应器的协同招募，从而突破衍射极限，达到单分子分辨能力。正交验证结果显示，CDegSR标记的荧光 puncta 与单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）信号高度共定位，皮尔逊相关系数达0.77，假阳性率和假阴性率均低于10%，且标记本身不改变目标RNA的表达丰度与周转速率。研究团队还成功将该技术应用于多种RNA类型的成像，包括NEAT1、7SK、SatIII以及表达丰度极低（nTPM=5.2）的ZNF530 mRNA，充分证明了CDegSR系统的普适性与灵敏度。

图2：利用CDegSR平台对活细胞中内源性POLR2A mRNA动态的实时时空追踪

利用CDegSR平台，研究团队实现了对活细胞中POLR2A mRNA的高频单分子示踪，首次定量揭示了细胞核与细胞质之间mRNA扩散行为的显著差异（图2）。核内mRNA呈现亚扩散或受限迁移特征，暗示染色质结构、核体及蛋白网络所形成的密集核环境对转录本形成物理束缚；而胞质中的mRNA则扩散更为自由。进一步实验表明，当使用嘌呤霉素阻断翻译后，mRNA的跳跃距离、扩散系数、异常扩散标度指数及分形维数均发生明显变化，提示翻译机器本身也参与调节mRNA的胞质扩散行为。这一发现为深入理解mRNA在细胞质中的命运调控机制提供了崭新的视角。

本研究得到了国家自然科学基金、重庆市自然科学基金等项目的资助。

全文链接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.77533